Les différence principale entre la chromatographie en phase inverse et la chromatographie d'interaction hydrophobe est que le la chromatographie en phase inverse (RPC) utilise un milieu plus hydrophobe, ce qui conduit à des interactions plus fortes tandis que la chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC) utilise un milieu moins hydrophobe par rapport au milieu de la chromatographie en phase inverse.

La chromatographie en phase inverse et la chromatographie d'interaction hydrophobe sont deux techniques chromatographiques qui dépendent des interactions entre les surfaces hydrophobes d'un support de chromatographie et les plaques hydrophobes à la surface des biomolécules.

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Qu'est-ce que la chromatographie en phase inverse

La chromatographie en phase inverse (RPC) est une technique chromatographique utilisée dans la purification et l'analyse de biomolécules telles que les protéines, les peptides et les oligonucléotides. Il donne une séparation à haute résolution et est idéal pour la cartographie peptidique et le contrôle de pureté. Le RPC est plus souvent utilisé dans le polissage final des peptides et des oligonucléotides.

Deux principaux types de milieux hydrophobes peuvent être utilisés comme phase stationnaire: des billes de silice recouvertes de chaînes carbonées ou, des polymères hydrophobes nus. Une colonne est garnie du milieu hydrophobe sous la forme d'un lit garni sur lequel l'échantillon est appliqué. Un agent d'appariement d'ions tel que l'acide trifluoroacétique (TFA) peut être ajouté à la phase mobile pour améliorer la formation d'interactions hydrophobes. Un modificateur organique tel que 5% d'acétonitrile est utilisé au début et l'élution peut être initiée avec l'augmentation du % d'acétonitrile.

Figure 1: Théorie de la chromatographie en phase inverse

Les biomolécules qui sont moins hydrophobes/plus polaires seront éluées en premier tandis que les molécules plus hydrophobes seront éluées plus tard. La RPC est la technique chromatographique avec la résolution la plus élevée.

Qu'est-ce que la chromatographie d'interaction hydrophobe

La chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC) est l'autre technique utilisée dans la séparation de biomolécules basée sur l'hydrophobie dans des conditions modérées. C'est une technique idéale pour la purification des protéines lorsque les échantillons doivent être soumis à une précipitation au sulfate d'ammonium lors de la concentration et du nettoyage de l'échantillon initial. Le niveau de sel élevé pendant la précipitation du sulfate d'ammonium augmente l'interaction entre les composants hydrophobes.

Figure 2: Effet d'une concentration élevée en sel sur les interactions hydrophobes

Le milieu hydrophobe de HIC est constitué d'une matrice inerte de particules sphériques enrobées de ligands contenant des groupements alkyle ou aryle. Les interactions hydrophobes se produisent sous des concentrations de sel modérément élevées (généralement 1–2 M de sulfate d'ammonium ou 3 M de NaCl). Le tampon de démarrage assure la liaison des protéines d'intérêt au milieu tout en lavant les impuretés. Le tampon d'élution contient une faible concentration en sel, affaiblissant l'interaction entre les protéines et la phase stationnaire.

Similitudes entre la chromatographie en phase inverse et la chromatographie d'interaction hydrophobe

Différence entre la chromatographie en phase inverse et la chromatographie d'interaction hydrophobe

Définition

La chromatographie en phase inverse (RPC) fait référence à la technique de séparation la plus haute résolution basée sur l'hydrophobie des molécules dans un mélange, tandis que la chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC) fait référence à un type de technique de séparation basée sur l'hydrophobie mais qui fonctionne dans des conditions relativement douces.

Hydrophobie

Le RPC fonctionne dans des conditions plus hydrophobes tandis que le HIC fonctionne dans des conditions hydrophobes relativement douces.

Interactions

La chromatographie en phase inverse conduit à des interactions plus fortes entre les molécules et la phase stationnaire qui doit être inversée lors de l'élution par un modificateur organique, tandis que HIC conduit à des interactions modérément élevées entre la phase stationnaire et les molécules.

Milieux hydrophobes

Le RPC utilise soit des billes de silice recouvertes de chaînes carbonées, soit des polymères hydrophobes nus tandis que le HIC utilise une matrice inerte de particules sphériques recouvertes de ligands contenant des groupes alkyle ou aryle.

Tampon de démarrage

Le tampon de démarrage dans RPC utilise de l'acide trifluoroacétique (TFA) tandis que le tampon de démarrage de HIC utilise des concentrations de sel modérément élevées.

Élution

Le pourcentage accru d'acétonitrile commence l'élution en RPC tandis que la concentration en sel décroissante commence l'élution en HIC.

Résolution

La chromatographie en phase inverse est la technique chromatographique avec la résolution la plus élevée tandis que la résolution de HIC est faible par rapport à RPC.

Applications

Le RPC est utilisé dans la séparation des protéines, des peptides et des oligonucléotides, tandis que le HIC est principalement utilisé dans la purification des protéines.

Conclusion

La chromatographie en phase inverse est la technique chromatographique avec la résolution la plus élevée, qui fonctionne dans des conditions hautement hydrophobes. Mais, HIC fonctionne dans des conditions hydrophobes modérées. RPC et HIC sont les deux types de techniques de séparation basées sur l'hydrophobie. La principale différence entre RPC et HIC est le degré d'hydrophobie utilisé dans chaque technique.

Référence:

1. Interaction hydrophobe et chromatographie en phase inversée: principes et méthodes. GE Healthcare, 2006. Disponible ici

Image de courtoisie:

1. «Schéma d'élution du gradient de phase inverse» de Nategm - Travail personnel (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia 2. «Hicsalt» de Daliak sur Wikibooks anglais - Transféré de en.wikibooks à Commons. (Domaine public) via Commons Wikimedia