Différence principale - PCR vs RT-PCR

La PCR et la RT-PCR sont deux techniques importantes en biologie moléculaire. La PCR a été développée par Kary Mullis dans les années 1980. Il est capable d'augmenter le nombre de copies d'un gène particulier de manière exponentielle, facilitant la détection de ce fragment d'ADN particulier. La Taq Polymerase est l'enzyme la plus fréquemment utilisée dans les systèmes PCR. C'est une enzyme thermostable. En RT-PCR, la transcription inverse est suivie d'une PCR. L'enzyme, la transcriptase inverse, est impliquée dans la synthèse d'ADN complémentaire à partir d'ARN. Les différence principale entre la PCR et la RT-PCR est que La PCR utilise l'ADN double brin comme matrice alors que la RT-PCR utilise l'ARN comme matrice.

Domaines clés couverts

1. Qu'est-ce que la PCR - Définition, processus, application 2. Qu'est-ce que la RT PCR - Définition, caractéristiques, application 3. Quelle est la différence entre la PCR et la RT PCR – Comparaison des principales différences

Termes clés: PCR, RT-PCR, réaction en chaîne par polymérase, transcription inverse-réaction en chaîne par polymérase, matrice d'ADN, ADN polymérase, dénaturation, recuit, extension d'amorce

Qu'est-ce que la PCR

PCR (Réaction en chaîne par polymérase) est une méthode relativement simple mais révolutionnaire. La PCR utilise la capacité de l'enzyme, l'ADN polymérase, à synthétiser de nouveaux brins d'ADN de manière complémentaire au brin matrice proposé. La PCR est une technique indispensable utilisée dans les laboratoires cliniques et de recherche pour l'analyse fonctionnelle des gènes, le diagnostic et la surveillance des maladies héréditaires, le clonage d'ADN, le séquençage et l'amplification d'ADN ancien. La matrice d'ADN, les nucléotides, les amorces et l'ADN polymérase sont les quatre principaux composants de la PCR. Les modèle d'ADN est généralement un ADN double brin avec la séquence cible, qui doit être amplifié. Taq ADN polymérase qui est isolé de Thermus aquatics est couramment utilisé en PCR. Les Pfu ADN polymérase est un autre type d'ADN polymérase à haute fidélité. Les polymérases Taq et Pfu sont toutes deux résistantes à la chaleur. Les nucléotides ajoutés par les ADN polymérases sont l'adénine (A), la guanine (G), la cytosine (C) et la thymine (T). Étant donné que l'ADN polymérase ne peut ajouter qu'un nouveau nucléotide dans une extrémité 3' d'un brin d'ADN préexistant, une amorce oligonucléotidique est nécessaire pour l'initiation de la synthèse d'ADN. L'exigence d'une amorce en PCR permet de délimiter uniquement une région spécifique dans la matrice. La séquence cible est flanquée d'amorces directe et inverse. À la fin d'une PCR, de nouvelles copies appelées amplicons d'une séquence d'ADN spécifique s'accumulent par milliards. Les composants de la PCR doivent être optimisés de manière à améliorer les performances de la PCR tout en minimisant les échecs.

La PCR est un processus automatisé effectué par des thermocycleurs, capables de basculer entre différentes températures. La PCR est un processus en trois étapes.

1. Dénaturation – La matrice d'ADN double brin est séparée en deux brins simples par chauffage à 94-95 °C.
2. recuit – Les amorces directe et inverse se lient aux séquences complémentaires de la matrice. La température de cette étape dépend de la température de fusion de la combinaison de primaire.
3. Rallonge d'apprêt - L'enzyme ADN polymérase étend chacune des amorces à leur extrémité 3' en ajoutant des bases complémentaires au brin en croissance. La température optimale de la polymérase Taq, 72 °C, est utilisée comme température dans l'étape d'extension. Le temps de l'extension dépend du nombre de paires de bases dans le brin modèle.

Les trois étapes sont répétées 28 à 35 fois.

Figure 1: Réaction en chaîne par polymérase

Les produits de la PCR sont fractionnés par taille par électrophorèse sur gel d'agarose en comparaison avec une échelle d'ADN. La visualisation de l'ADN sur gel d'agarose se fait par coloration au bromure d'éthidium et observation sous UV. Les bandes d'ADN amplifiées sous UV dans un gel coloré au bromure d'éthidium sont montrées dans la figure 2. L'échelle d'ADN est montrée dans le puits le plus à gauche.

Figure 2: bandes d'ADN

Qu'est-ce que la RT-PCR

RT-PCR (Transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase) est l'une des techniques les plus sensibles utilisées pour la détection de l'ARNm. L'ARN est le modèle approprié pour recueillir des informations soit sur l'expression génique d'un tissu normal, soit sur l'expression génique d'un tissu infecté. La matrice pour la RT-PCR peut être respectivement de l'ARN total ou de l'ARN viral ou bactérien. L'ARN est inversement transcrit en ADN complémentaire (ADNc) par l'enzyme, la transcriptase inverse. La température optimale de la transcriptase inverse est de 46 °C. L'ADNc est utilisé en PCR afin d'obtenir le produit. Les étapes de la PCR de transcription inverse sont illustrées à la figure 3.

Figure 3: RT-PCR

La RT-PCR peut être effectuée dans des réactions en deux étapes ou en une étape. Dans la réaction en deux étapes, la transcription inverse et la PCR sont effectuées en deux étapes distinctes. Dans la RT-PCR en une étape, la transcription inverse est suivie d'une PCR dans un seul tube de manière séquentielle. L'ADNc et le produit PCR final peuvent être exécutés sur un gel d'agarose à des fins de fractionnement et de visualisation. La RT-PCR en une et deux étapes est illustrée à la figure 4.

Figure 4: RT-PCR en une et deux étapes

Différence entre la PCR et la RT-PCR

Définition

PCR: La PCR est une technique utilisée en biologie moléculaire pour amplifier un segment d'ADN générant des millions de copies d'une séquence d'ADN.

RT-PCR: La RT-PCR est une variante de la PCR utilisée dans la détection de l'expression génique en biologie moléculaire.

Pas

PCR: La dénaturation, l'annelage et l'extension sont les trois étapes de la PCR.

RT-PCR: En RT-PCR, la transcription inverse est suivie d'une PCR.

Modèle

PCR: Une molécule d'ADN double brin sert de matrice pour la PCR.

RT-PCR: Une molécule d'ARN simple brin sert de matrice pour la transcription inverse. Une molécule d'ADN simple brin sert de matrice pour la PCR.

Enzymes utilisées

PCR: L'ADN polymérase est utilisée comme enzyme dans la PCR.

RT-PCR: La transcriptase inverse et l'ADN polymérase sont utilisées comme enzymes dans la RT-PCR.

Amorces

PCR: Des amorces directes et inverses sont utilisées dans la PCR.

RT-PCR: Seule l'amorce inverse est utilisée pour la transcription inverse et les amorces directe et inverse sont utilisées dans la PCR.

Sensibilité

PCR: La PCR est une méthode sensible.

RT-PCR: La RT-PCR est plus sensible que la PCR.

Applications

PCR: La PCR est utilisée dans l'analyse fonctionnelle des gènes, le diagnostic et la surveillance des maladies héréditaires, le clonage de l'ADN, le séquençage de l'ADN et l'amplification de l'ADN ancien.

RT-PCR: La RT-PCR est utilisée dans la détection de l'expression des gènes.

Conclusion

La PCR et la RT-PCR sont deux des techniques importantes utilisées en biologie moléculaire. La PCR et la RT-PCR sont toutes deux des techniques automatisées capables d'augmenter de façon exponentielle le nombre de copies d'une séquence d'ADN cible, qui est définie par les amorces directe et inverse. En PCR, l'ADN double brin est utilisé comme matrice. Par PCR, le clonage d'ADN, le séquençage d'ADN et l'analyse fonctionnelle des gènes peuvent être effectués. En RT-PCR, l'expression génique dans un tissu particulier peut être observée en amplifiant l'ARN. La principale différence entre la PCR et la RT-PCR réside dans leurs modèles utilisés dans chaque réaction et leurs applications.

Référence:

1. "Réaction en chaîne par polymérase (PCR)." Centre national d'information sur la biotechnologie. Bibliothèque nationale de médecine des États-Unis, s.d. La toile. Disponible ici. 01 juin 2017. 2. "Réaction en chaîne par polymérase (ou PCR)." Clonage et analyse moléculaire des gènes. N.p., s.d. La toile. Disponible ici. 01 juin 2017. 3. Biolabs, Nouvelle-Angleterre. « Synthèse d'ADNc et RT-PCR ». Synthèse d'ADNc et RT-PCR | BEC. N.p., s.d. La toile. Disponible ici. 01 juin 2017.

Image de courtoisie:

1. "Réaction en chaîne par polymérase" Par Enzoklop - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Par Rainis Venta - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 3. «Réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse» Par Jpark623 - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 4. «Une étape vs deux étapes RT-PCR »Par Jpark623 - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia