Différence principale - PCR vs QPCR

La PCR (réaction en chaîne par polymérase) et la qPCR (PCR quantitative) sont deux techniques utilisées en biotechnologie pour amplifier l'ADN à diverses fins. La PCR est une technique relativement simple. La qPCR est également connue sous le nom de Pcr en temps réel ou PCR numérique. Les différence principale entre la PCR et la qPCR est que La PCR est une technique qualitative alors que la qPCR est une technique quantitative. La PCR permet de lire le résultat comme « présence ou absence ». Mais en qPCR, la quantité d'ADN amplifié à chaque cycle est quantifiée. Si l'ARN est utilisé en PCR, la technique est connue sous le nom de RT-PCR (PCR de transcription inverse), et si l'ARN est utilisé en qPCR, la technique est connue sous le nom de qRT-PC.

Domaines clés couverts

1. Qu'est-ce que la PCR - Définition, processus, utilisations 2. Qu'est-ce que la QPCR - Définition, processus, utilisations 3. Quelles sont les similitudes entre la PCR et la QPCR – Aperçu des caractéristiques communes 4. Quelle est la différence entre la PCR et la QPCR – Comparaison des principales différences

Mots-clés: électrophorèse sur gel d'agarose, amplicons, ADN polymérase, colorant fluorescent, PCR, sondes, qPCR, RT-qPCR

Qu'est-ce que la PCR

La PCR fait référence à une technique en biotechnologie qui permet l'analyse d'une courte séquence d'ADN en amplifiant un segment sélectionné d'ADN. C'est une méthode relativement sensible car de très petits volumes sont requis par une seule réaction. La technique est basée sur la capacité de l'ADN polymérase à synthétiser de nouveaux brins d'ADN au brin matrice proposé de manière complémentaire. Le mélange réactionnel de la PCR est composé d'ADN polymérase, de nucléotides d'ADN, d'amorces, de la matrice d'ADN à amplifier et de magnésium. L'amplification est réalisée à l'intérieur d'un thermocycleur. L'ADN polymérase doit être résistante à la chaleur car des températures élevées sont utilisées dans cette réaction. Les deux types d'ADN polymérases utilisés en PCR sont l'ADN polymérase Taq et l'ADN polymérase Pfu. La Taq ADN polymérase est largement utilisée en PCR.

L'ADN polymérase nécessite un brin d'ADN préexistant à l'extrémité 3' pour synthétiser un nouveau brin. Par conséquent, une amorce oligonucléotidique est ajoutée au mélange réactionnel pour l'initiation de la synthèse d'ADN. L'exigence d'une amorce en PCR permet l'amplification d'une seule région spécifique dans la matrice. La séquence cible est flanquée d'amorces directe et inverse. À la fin d'une PCR, de nouvelles copies d'une séquence d'ADN spécifique, appelées amplicons, s'accumulent en milliards. Les composants de la PCR doivent être optimisés de manière à améliorer les performances de la PCR tout en minimisant les échecs. La réaction PCR standard est illustrée à la figure 1.

Figure 1: PCR

Étapes de la PCR

Les trois étapes d'une PCR sont décrites ci-dessous.

1. Dénaturation – La matrice d'ADN double brin est séparée en deux brins simples par chauffage à 94-95 °C.
2. recuit – Les amorces directe et inverse se lient aux séquences complémentaires de la matrice. La température dépend de la température de fusion de la combinaison de primaire.
3. Rallonge d'apprêt - L'enzyme ADN polymérase étend chaque amorce à leur extrémité 3' en ajoutant des bases complémentaires au brin en croissance. La température optimale de la polymérase Taq, c'est-à-dire 72 °C, est utilisée comme température dans l'étape d'extension. Le temps de l'extension dépend du nombre de paires de bases dans le brin modèle.

Les trois étapes sont répétées 28 à 35 fois. L'électrophorèse sur gel d'agarose est utilisée dans le fractionnement par taille des produits de PCR. Le produit est coloré au bromure d'éthidium et est observé sous UV. Le produit PCR ou l'ADN amplifié peuvent être utilisés dans le clonage, le séquençage ou le génotypage.

Qu'est-ce que la QPCR

La QPCR fait référence à une technique en biotechnologie qui permet la détection, la caractérisation et la quantification d'acides nucléiques pour diverses applications. Par conséquent, il s'agit d'un type de PCR quantitative. L'ADN et l'ARN peuvent tous deux être utilisés en qPCR. Si l'ARN est utilisé comme matrice, il doit d'abord être rétro-transcrit en ADNc. Ainsi, ce type de qPCR est connu sous le nom RT-qPCR. La PCR traditionnelle est réalisée pour un échantillon d'ADNc ou d'ADN usuel. Cependant, en qPCR, des colorants fluorescents sont utilisés pour marquer le produit PCR à chaque étape du cycle PCR. Cela permet la collecte de données au fur et à mesure que la PCR progresse, permettant la quantification des amplicons pendant la phase exponentielle de la PCR. Le principal type de colorant utilisé en qPCR est le SYBR Green. Le colorant se lie à l'ADN double brin. Comme la fluorescence est augmentée proportionnellement à la quantité d'ADN amplifié, la quantification peut se faire en « temps réel ». Le principal inconvénient de l'utilisation du colorant est qu'il permet la quantification d'un produit spécifique dans l'échantillon. En plus des colorants, des sondes peuvent également être utilisées dans le processus de quantification. Les sondes TaqMan sont l'un des principaux types de sondes oligonucléotidiques utilisées en qPCR, et le processus d'émission de fluorescence est illustré à la figure 2.

Figure 2: Sonde TaqMan

Les sondes peuvent être conçues de manière à détecter plusieurs produits PCR dans le même échantillon. La sonde TaqMan est l'un des principaux types de sondes d'hydrolyse; l'incorporation de cette sonde dans le produit PCR expose le fluorophore, émettant la fluorescence. Les colorants fluorescents sont plus spécifiques au produit PCR. Par conséquent, ils sont utilisés dans la plupart des tests de diagnostic pour détecter le produit PCR.

Similitudes entre la PCR et la QPCR

Différence entre la PCR et la QPCR

Définition

PCR: La PCR est une technique en biotechnologie qui permet l'analyse d'une courte séquence d'ADN en amplifiant un segment sélectionné d'ADN.

QPCR: La QPCR est une technique en biotechnologie qui permet la détection, la caractérisation et la quantification d'acides nucléiques pour diverses applications.

Quantitatif qualitatif

PCR: La PCR est une technique qualitative.

QPCR: La QPCR est une technique quantitative.

Détection du produit

PCR: Le produit est détecté par électrophorèse sur gel d'agarose en PCR.

QPCR: Le produit peut être détecté dans chaque cycle d'amplification en qPCR.

Collecte de données

PCR: Les données sont recueillies à la fin de la réaction en PCR.

QPCR: Les données sont collectées pendant la phase exponentielle de la réaction en qPCR.

Résolution

PCR: La PCR a une très mauvaise résolution.

QPCR: QPCR a une très haute résolution.

Teintures

PCR: La PCR utilise du bromure d'éthidium pour colorer le produit pendant la PCR.

QPCR: La QPCR utilise des colorants fluorescents pour détecter le produit.

Temps

PCR: La PCR est une méthode qui prend plus de temps.

QPCR: La QPCR prend moins de temps.

ARN

PCR: La RT-PCR est le type de PCR qui utilise l'ARN comme matrice.

QPCR: La RT-qPCR est le type de qPCR qui utilise l'ARN comme matrice.

Rôle

PCR: La PCR est utilisée pour détecter la présence ou l'absence de certains fragments génomiques.

QPCR: La QPCR est utilisée pour quantifier un fragment particulier dans un échantillon.

Conclusion

La PCR et la qPCR sont deux types de techniques utilisées en biotechnologie pour amplifier l'ADN à diverses fins. La PCR est la méthode d'amplification traditionnelle utilisée pour identifier la présence ou l'absence d'un fragment d'ADN. La QPCR est utilisée pour quantifier un fragment particulier dans un échantillon. Ainsi, la PCR est une technique qualitative alors que la qPCR est une technique quantitative. C'est la principale différence entre la PCR et la qPCR.

Référence:

1. "QPCR vs. PCR numérique vs. PCR traditionnelle." Thermo Fisher Scientific, disponible ici.

Image de courtoisie:

1. "PCR" de Madprime - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia2. "Taqman" par utilisateur: Braindamaged - Travail personnel du téléchargeur d'origine (domaine public) via Commons Wikimedia