Les combinaisons oligo-dT/support sont principalement utilisées dans la purification d'ARNm à partir d'ARN total par une technique connue sous le nom de chromatographie d'affinité. Il existe deux méthodes principales pour isoler l'ARNm de l'ARN total en fonction du type de cellules; à savoir, méthode directe d'isolement d'ARNm et méthode moins d'isolement d'ARNm. Les deux méthodes sont expliquées dans cet article.

L'ARN messager (ARNm) est un produit de transcription composé d'une série de nucléotides d'ARN. Il transporte l'information dans les gènes du noyau au cytoplasme pour la synthèse des protéines. L'isolement d'ARN à partir d'une lignée cellulaire particulière donne un ARN total, qui se compose d'ARNr et d'ARNt ainsi que d'ARNm. Par conséquent, l'ARNm doit être séparé du mélange d'ARN total lors de l'étude du transcriptome de la lignée cellulaire. Des propriétés uniques de l'ARNm telles que la présence d'une queue poly(A) à l'extrémité 3' de la molécule d'ARNm sont utilisées pour la séparation. Étant donné que les molécules oligo-dT sont complémentaires de la queue poly(A), l'ARNm peut être isolé à partir d'un mélange d'ARN total.

Domaines clés couverts

1. Qu'est-ce que l'ARNm - Définition, structure, fonction 2. Quelle est la composition de l'ARN total – ARNm, ARNr, ARNt 3. Comment isoler l'ARNm de l'ARN total – Utilisation d’Oligo-dT/Molécules véhiculées

Termes clés: chromatographie d'affinité, ARN messager (ARNm), méthode Minus, Oligo dT, queue Poly (A), ARN total

Qu'est-ce que l'ARNm

L'ARNm est un transcrit d'un gène codant pour une protéine. Il est produit à l'intérieur du noyau chez les eucaryotes et transporte des informations pour la production d'une protéine particulière dans le cytoplasme. Il est traduit en une séquence d'acides aminés de la protéine lors de la traduction, assistée par les ribosomes. Le transcrit primaire produit par la transcription des eucaryotes est appelé le pré-ARNm.

Figure 1: structure de l'ARNm

Au cours des modifications post-transcriptionnelles, une molécule d'ARNm mature est produite avec plusieurs caractéristiques telles que la coiffe 5' et la queue poly(A). L'ARNm total d'un organisme particulier est connu sous le nom de transcriptome.

Quelle est la composition de l'ARN total

Le résultat de l'isolement de l'ARN est appelé ARN total. Il est composé des trois principaux types d'ARN produits par une cellule. Ce sont l'ARNm, l'ARNt et l'ARNr. L'ARNt et l'ARNr contribuent tous deux à la traduction. La taille de l'ARNm eucaryote est de 0,5 à 20 kb. L'ARN de transfert (ARNt) apporte les acides aminés correspondants lors de la traduction. Il a une longueur de 76 à 90 paires de bases et est composé d'une région d'anticodon, qui est complémentaire d'un codon particulier sur l'ARNm. L'ARN ribosomique (ARNr) est un composant des ribosomes. Certains des ARNr humains ont une longueur de 5 kb.

Plus de 90 % de l'ARN total est composé d'ARNt et d'ARNr. Seulement 1 à 5 % de l'ARN total est de l'ARNm. Une cellule de mammifère typique peut être constituée d'environ 500 000 molécules d'ARNm par cellule. La quantité d'un type particulier d'ARNm peut être de 15 à 20 000 copies par cellule.

Comment isoler l'ARNm de l'ARN total

Un certain nombre de techniques de biologie moléculaire telles que la construction de bibliothèques d'ADNc, la préparation d'échantillons pour la préparation de puces à ADN, l'analyse par transfert Northern pour les gènes faiblement exprimés, etc. nécessitent un ARNm de haute qualité. Il existe deux méthodes principales pour isoler l'ARNm de l'ARN total en fonction du type de cellules: la méthode directe d'isolement de l'ARNm et la méthode moins d'isolement de l'ARNm.

Méthode directe d'isolement de l'ARNm

Le principe de la séparation des ARNm matures des ARN totaux eucaryotes implique la sélection d'affinité/chromatographie d'affinité des ARNm polyadénylés avec l'utilisation d'oligo dT (oligodeoxthymidylate), qui est complémentaire de la queue poly(A). Elle est rendue possible par l'absence de queue poly(A) dans les deux autres types d'ARN: l'ARNt et l'ARNr.

L'ARNm se compose de 30 à 200 nucléotides d'adénine dans sa queue poly(A). Des colonnes d'affinité remplies d'une combinaison oligo dT/support sont utilisées pour isoler l'ARNm de l'ARN total. La combinaison oligo dT/support peut être soit un oligo dT lié à la cellulose, un oligo dT biotinylé avec des billes magnétiques couplées à la streptavidine ou des billes de polystyrène-latex couplées à un oligo dT. Toutes les conditions expérimentales doivent être dans des conditions sans RNase pour empêcher la dégradation enzymatique de l'ARN.

Figure 2: Chromatographie d'affinité

L'ARN total doit être dissous dans un tampon à haute teneur en sel et chauffé brièvement à 65-70 ° C pour perturber les structures secondaires de l'ARN. Les conditions d'isolement de l'ARN varient selon les kits disponibles dans le commerce pour l'isolement de l'ARNm. Cependant, la préparation de poly(A)-ARN ou ARNm est composée de trois étapes.

1. Hybridation de poly(A)-ARN à des molécules oligo dT connectées à un support
2. Lavage de l'ARN non lié
3. Élution de poly(A)-ARN à partir d'une combinaison oligo-dT/support dans des conditions de faible stringence

Moins la méthode d'isolement de l'ARNm

La purification de l'ARNm basée sur l'oligo dT ne produit que de l'ARNm avec une queue poly(A) ou un ARNm eucaryote mature. Par conséquent, une autre méthode connue sous le nom de méthode moins peut être utilisée dans la purification de l'ARNm qui n'a pas de queue poly(A). Cette méthode peut être utilisée dans l'isolement d'ARNm de levure et d'ARN total bactérien. Il peut également être utilisé dans l'isolement de type immature d'ARNm avec l'ARNm mature de cellules eucaryotes. Il implique l'enrichissement du transcriptome en éliminant les gros ARN ribosomiques de l'ARN total. Le RiboMinus^MT Le kit d'isolement du transcriptome de ThermoFisher Scientific utilise trois étapes pour purifier efficacement l'ARNm de l'ARN total de levure et de bactérie.

1. Hybridation de l'ARN total avec des sondes oligonucléotidiques 5' marquées à la biotine, spécifiques à la séquence d'ARNr
2. Élimination du complexe de sonde marqué ARNr/5′-biotine avec les billes magnétiques revêtues de streptavidine
3. Purification des impuretés et élution de l'ARNm.

Conclusion

L'ARN total est composé des trois principaux types d'ARN: l'ARNm, l'ARNr et l'ARNt. La purification de l'ARNm à partir de l'ARN total est essentielle pour l'analyse du transcriptome d'un organisme particulier. Les méthodes de purification sont basées sur le type d'ARNm. L'ARNm eucaryote, qui contient une queue poly(A), peut être isolé par chromatographie d'affinité avec oligo dT. L'ARNm eucaryote immature et l'ARNm de levure et de cellules bactériennes peuvent être isolés en appauvrissant les gros ARNr de l'ARN total.

Référence:

1. « Extraction d'ARNm ». Thermo Fisher Scientific, disponible ici. 2. "Extraction d'ARN par type d'ARN." Thermo Fisher Scientific, disponible ici.

Image de courtoisie:

1. « ARNm mature » ​​(CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. « Affinité » de Jamit sur English Wikibooks - Transféré de en.wikibooks à Commons par Adrignola à l'aide de CommonsHelper (domaine public) via Commons Wikimedia