Les amorces sont un composant essentiel dans l'amplification de l'ADN à la fois in vivo et in vitro. In vivo, l'enzyme ADN polymérase nécessite une amorce pour l'initiation de la réplication de l'ADN. In vitro, les amorces sont principalement utilisées pour l'initiation de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Certaines autres techniques, notamment le séquençage, le clonage, la mutagenèse dirigée, etc. nécessitent des amorces. Par conséquent, la conception d'amorces pour les techniques in vitro devient assez simple mais constitue un processus difficile pour les biologistes moléculaires. Par conséquent, les règles de base pour la conception de l'amorce pour la PCR et le séquençage sont discutées dans cet article.

Domaines clés couverts

1. Qu'est-ce qu'une amorce - Définition, types, rôle 2. Comment fonctionnent les amorces dans une PCR – Caractéristiques de l'ADN, processus de PCR 3. Comment faire des amorces pour la PCR – Règles de base pour concevoir des amorces PCR 4. Comment concevoir une amorce de séquençage – Caractéristiques des amorces de séquençage

Termes clés: synthèse d'ADN, amorces directes, longueur, température de fusion, PCR, amorces inverses, amorces de séquençage

Qu'est-ce qu'une amorce

Une amorce est un court brin d'ADN ou d'ARN qui sert de point de départ à la synthèse d'ADN. Les enzymes qui catalysent la réplication de l'ADN sont capables d'ajouter des nucléotides à une extrémité 3' existante. Par conséquent, l'amorce jette les bases de la synthèse d'ADN en servant d'amorce. Amorces d'ARN sont utilisés à l'intérieur de la cellule pour l'initiation de la réplication de l'ADN par l'ADN polymérase. Cependant, le synthétique amorces d'ADN peut être utilisé pour l'amplification de l'ADN, principalement par PCR et d'autres techniques. Deux types d'amorces sont utilisées dans la PCR, et elles sont connues sous le nom d'amorces directes et inverses. Au cours de la PCR, des millions de copies du fragment d'ADN souhaité peuvent être produites en flanquant cette séquence d'ADN particulière dans l'ADN génomique par des amorces directes et inverses. Les amorces directe et inverse qui flanquent une séquence d'ADN particulière sont illustrées à la figure 1.

Figure 1: Amorces directes et inverses

Comment fonctionnent les amorces en PCR

L'ADN est une molécule ayant deux brins qui sont maintenus ensemble. Le motif de paires de bases est complémentaire à chacun dans les deux brins. Les deux brins sont maintenus ensemble par les liaisons hydrogène entre les bases azotées complémentaires. De plus, chaque brin a sa propre directionnalité. Un brin a une directivité de 5' à 3' tandis que l'autre a une directivité de 3' à 5'. Les deux brins sont donc antiparallèles. Le brin avec la direction 5′ à 3′ est connu comme le brin sens tandis que le brin avec la direction 3′ à 5′ est connu comme le brin antisens. Chacun des deux brins doit être synthétisé individuellement pendant la PCR.

Les trois étapes de la PCR sont la dénaturation, l'hybridation et l'allongement. Lors de la dénaturation, les deux brins d'ADN sont séparés en rompant les liaisons hydrogène par chauffage à 95 °C. L'amorce directe se lie au brin sens tandis que l'amorce inverse se lie au brin antisens. Le recuit des amorces se produit lorsque la température chute de 95 °C à 50-60 °C. Par conséquent, les deux brins peuvent être synthétisés en même temps à l'aide de la Taq polymérase. L'amplification des brins sens et antisens se produit dans la direction 5' à 3'. La PCR étant une réaction exponentielle, les trois étapes sont répétées en 25-35 cycles. Des amorces directes et inverses sont utilisées dans chaque cycle pour produire environ 2³⁵ copies du fragment d'ADN souhaité. Le rôle des amorces dans la PCR est illustré à la figure 2.

Figure 2: PCR

Comment faire des amorces pour la PCR

Afin d'amplifier un fragment d'ADN particulier dans le génome, ce fragment d'ADN particulier doit être flanqué d'amorces directe et inverse. Par conséquent, les deux amorces doivent être complémentaires des séquences qui flanquent le fragment d'ADN. Les directives de base pour la conception réussie d'amorces PCR sont décrites ci-dessous.

1. La direction de l'amorce directe et inverse doit être de 5′ à 3′.
2. La longueur de chaque amorce doit être comprise entre 18 et 25 nucléotides.
3. La teneur en GC des amorces doit être comprise entre 40 et 60 % et la présence d'un C ou d'un G à l'extrémité 3' de l'amorce peut favoriser la liaison.
4. La température de fusion et la Tm (la température à laquelle la moitié de l'amorce s'est hybridée à la matrice) de la paire d'amorces doivent être similaires et supérieures à 60 °C. La différence maximale doit être de 5 °C.
5. L'extrémité 3' de l'amorce doit correspondre exactement à l'ADN matrice.
6. Au moins 2 bases G ou C (pince GC) doivent être présentes dans les 5 dernières bases à l'extrémité 3' de l'amorce. La pince GC favorise une forte liaison à la séquence cible.
7. Des sites de restriction avec 5-6 nucléotides peuvent être ajoutés à l'extrémité 5' de l'amorce.
8. Les répétitions dinucléotidiques (ATATATAT) ou les répétitions du même nucléotide plus de 4 fois (ACCCC) doivent être évitées dans les séquences d'amorces. Cela provoque une erreur d'amorçage.
9. L'homologie intra-amorce ou les structures secondaires des amorces doivent être évitées. L'homologie inter-amorces ou les séquences complémentaires dans les amorces directe et inverse doivent être évitées. Les deux conditions peuvent former des auto-dimères ou des amorces-dimères.
10. La valeur ΔG pour l'analyse des dimères doit être comprise entre 0 et -9 kcal/mole.

De nombreux outils en ligne sont disponibles pour faciliter la conception des amorces tels que Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar, etc. La spécificité des amorces conçues peut être déterminée par des outils tels que NCBI Primer-BLAST ou UCSC in-silico PCR.

Figure 3: Interface de l'amorce 3

Comment concevoir une amorce de séquençage

Les amorces de séquençage sont des brins d'ADN courts, tout comme les amorces PCR. Cependant, les amorces PCR sont conçues pour l'amplification d'un fragment d'ADN particulier, tandis que les amorces de séquençage sont utilisées pour révéler la séquence nucléotidique du fragment d'ADN amplifié par PCR. Contrairement aux amorces PCR, une seule amorce peut être utilisée dans le séquençage, si seulement la séquence cible a une longueur inférieure à 500 pb. A titre d'exemple, l'amorce directe de la PCR peut être utilisée dans le séquençage, pour n'amplifier que le brin sens. De plus, le degré de mésappariement toléré lors de la réaction de séquençage est supérieur à la PCR. Généralement, les amorces PCR sont complémentaires de la séquence cible. Cependant, certaines amorces de séquençage ne sont pas liées à la séquence cible. Ils sont connus sous le nom d'amorces universelles. Les amorces universelles telles que T7 ou SP6 s'hybrident au vecteur qui porte la séquence cible. Ils peuvent être utilisés à la fois pour une variété de vecteurs et pour divers types de fragments d'ADN.

Conclusion

Les amorces sont utilisées en PCR et en séquençage pour l'initiation de la synthèse d'ADN. Deux types d'amorces PCR peuvent être identifiés comme amorce directe et inverse. Les amorces directes s'hybrident au brin sens tandis que les amorces inverses s'hybrident au brin antisens. Dans le séquençage, une amorce directe ou inverse peut être utilisée pour amplifier la cible. Lors de la conception des amorces, de nombreux facteurs doivent être pris en compte, tels que la longueur de l'amorce, la Tm et la teneur en GC. De nombreux outils en ligne sont disponibles et peuvent être utilisés pour la conception d'amorces pour une séquence particulière.

Référence:

1. « Conception d'amorce: conseils pour un processus efficace ». Genome Compiler Corporation, 3 novembre 2015, disponible ici. 2. « Amorces de séquençage et conception d'amorces ». Amorces de séquençage et conception d'amorces, Université de Calgary, disponible ici.

Image de courtoisie:

1. "Primers RevComp" de Zephyris - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. "Réaction en chaîne par polymérase" de Enzoklop - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia