La transfection stable est l'introduction à long terme d'ADN étranger dans les cellules. Les cellules transfectées de manière stable transmettent l'ADN étranger à leur descendance. Par conséquent, pour fabriquer des lignées cellulaires transfectées de manière stable, l'ADN étranger doit être intégré dans le génome de la lignée cellulaire. Cependant, une hérédité stable peut également être observée dans l'ADN non génomique. Une transfection réussie et stable nécessite des méthodes efficaces d'administration d'ADN ainsi que des méthodes de sélection d'ADN étranger au sein de la lignée cellulaire. Les lignées cellulaires transfectées de manière stable sont utilisées pour un large éventail d'applications telles que la production de protéines recombinantes, les études de fonction génique, les tests de découverte de médicaments, etc.

Domaines clés couverts

1. Comment faire une lignée cellulaire transfectée stable – Protocole de génération de lignées cellulaires stables 2. Comment sélectionner l'ADN transfecté dans la lignée cellulaire – Sélection de lignées cellulaires transfectées de manière stable

Termes clés: maintenance épisomique, intégration dans le génome, plasmide, sélection, lignées cellulaires transfectées de manière stable

Comment faire une lignée cellulaire transfectée stable

La transfection est une méthode de transfert de gènes dans laquelle le matériel génétique est délibérément introduit dans la cellule hôte par des méthodes chimiques ou non chimiques. Il existe deux types de lignées cellulaires transfectées de manière stable:

1. Le principal type de lignées cellulaires stables est généré par l'intégration directe d'ADN transfecté dans le génome de l'organisme hôte. L'ADN transfecté est intégré dans le génome par recombinaison homologue.
2. L'autre méthode pour générer des lignées cellulaires stables est le maintien épisomique de l'ADN transfecté. Les vecteurs eucaryotes sont utilisés dans la transfection d'ADN qui ne sont pas intégrés dans le génome. Cependant, la stabilité de l'ADN épisomique est faible. De plus, les épisomes ne sont maintenus que par certains types d'espèces. Les lignées cellulaires transfectées de manière stable sont présentées sur la figure 1.

Figure 1: Lignées cellulaires transfectées de manière stable

Traiter

Les étapes impliquées dans la génération de lignées cellulaires stables sont décrites ci-dessous.

1. Génération d'une courbe de destruction déterminant la concentration optimale d'antibiotique de sélection - Les cellules sont soumises à des quantités croissantes de concentration d'antibiotique pour déterminer la concentration minimale d'antibiotique requise pour tuer toutes les cellules sur une semaine.
2. Transfection de cellules avec la construction plasmidique souhaitée - La méthode de transfection diffère selon le type de cellules hôtes. Les réactifs liposomiques sont utilisés dans la transfection de lignées cellulaires adhérentes. L'électrotransfection ou des méthodes virales sont utilisées pour transfecter des lignées cellulaires en suspension.
3. Sélectionnez et développez des colonies polyclonales stables - À 48-72 heures de transfection, des concentrations élevées, optimales et faibles d'antibiotiques sélectifs sont ajoutées aux cultures pour obtenir les lignées cellulaires transfectées de manière stable.

Comment sélectionner l'ADN transfecté dans les lignées cellulaires

Les marqueurs de sélection sont co-exprimés avec l'ADN transfecté pour la sélection de cellules transfectées avec succès. Le gène marqueur pourrait être dans le même vecteur (cis) utilisé pour transfecter la cellule hôte ou sur un autre vecteur (trans). La résistance aux antibiotiques tels que la néomycine, la zéocine, l'hygromycine, la puromycine, la DHFR, etc. peut être utilisée dans la sélection. De plus, les gènes transfectés peuvent être marqués avec la GFP.

Conclusion

Des lignées cellulaires stables peuvent être principalement produites en intégrant de l'ADN transfecté dans le génome. En outre, le maintien épisomique de l'ADN transfecté peut également être utilisé pour créer des lignées cellulaires stables pendant une longue période de temps dans certains organismes hôtes. Une méthode de sélection devrait être là pour l'identification de l'ADN transfecté dans la lignée cellulaire.

Référence:

1. «Protocole de génération de lignées cellulaires stables». Creative BioMart, disponible ici.

Image de courtoisie:

1. "Production de souris Knockout 2" de Kjaergaard - Travail personnel (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia