La mutagenèse dirigée (SDM) est une méthode in vitro de création d'une mutation dans une séquence connue. Elle est souvent réalisée par des méthodes basées sur la PCR. Typiquement, une ou deux bases sont modifiées dans la mutagenèse dirigée. Les amorces peuvent être conçues avec les mutations souhaitées pour introduire de petits changements dans la séquence nucléotidique. L'extension d'amorce et la PCR inverse peuvent être utilisées pour introduire des mutations à grande échelle. Cette approche peut modifier la composition en acides aminés d'une protéine particulière. La mutagenèse dirigée est utilisée pour étudier les changements de l'activité des protéines. Il est également utilisé pour créer des protéines de fusion.

Domaines clés couverts

1. Qu'est-ce que la mutagenèse dirigée (SDM) - Définition, rôle, méthode 2. Comment concevoir des amorces pour la mutagenèse dirigée sur site – Substitutions, suppressions, insertions

Termes clés: suppressions, insertions, mutations, mutagenèse dirigée, substitutions, PCR traditionnelle

Qu'est-ce que la mutagenèse dirigée

La mutagenèse dirigée est une technique de biologie moléculaire utilisée pour introduire des changements spécifiques dans une séquence nucléotidique d'un gène. Il est utilisé pour modifier la séquence d'acides aminés d'une protéine, introduire ou supprimer des sites de restriction, détruire des sites de liaison à la transcription et créer des protéines de fusion.

Traiter

Au cours de la mutagenèse dirigée, les mutations sont introduites dans les plasmides à l'aide d'amorces, constituées de la mutation souhaitée. La matrice entière est amplifiée par PCR, incorporant la mutation dans la matrice. Ensuite, la matrice parente est retirée de l'échantillon à l'aide d'une enzyme, une endonucléase dépendante de la méthylation. Le produit de PCR ou la molécule plasmidique coupée avec la mutation souhaitée est transformé en bactérie. Les plasmides peuvent être isolés des bactéries avec les modifications souhaitées. Le processus de mutagenèse dirigée est montré sur la figure 1.

Figure 1: Mutagenèse dirigée

Trois principaux types de méthodes sont utilisés pour introduire les mutations souhaitées dans la mutagenèse dirigée. Il s'agit de la PCR traditionnelle, de l'extension d'amorce et de la PCR inverse. L'extension d'amorce et la PCR inverse peuvent être utilisées pour introduire des changements de nucléotides à grande échelle.

PCR traditionnelle

La PCR traditionnelle peut être utilisée pour introduire un ou deux changements de nucléotides dans la séquence cible avec des amorces modifiées. Les changements peuvent être des substitutions, des suppressions ou des ajouts de nucléotides. La mutation est incorporée dans l'amplicon pendant la PCR. Par conséquent, la séquence d'origine est remplacée par la séquence mutée dans l'amorce.

Extension d'amorce

Dans l'extension d'amorce, la mutation souhaitée est incorporée au cours d'une PCR nichée. Ici, la séquence cible est flanquée de deux amorces. La mutation souhaitée est incorporée dans l'amorce interne et la mutation est introduite dans le deuxième cycle de PCR. Généralement, la spécificité d'une réaction PCR diminue avec l'augmentation du nombre de nucléotides mésappariés dans les amorces. Cependant, de longues amorces internes avec des mutations à grande échelle peuvent être utilisées dans l'extension d'amorce car la PCR nichée peut augmenter la spécificité de la réaction PCR.

PCR inverse

La PCR inverse est une méthode d'amplification de fragments d'ADN inconnus en concevant des amorces pour une séquence d'ADN connue. Il peut être utilisé pour substituer, supprimer ou insérer des nucléotides à grande échelle.

Les applications de la mutagenèse dirigée sont décrites ci-dessous.

1. Étudier la structure, la fonction et les propriétés catalytiques des protéines
2. Améliorer les propriétés des protéines (ingénierie des protéines)
3. Pour introduire ou supprimer des sites d'endonucléases de restriction.

Comment concevoir des amorces pour la mutagenèse dirigée sur site

La mutagenèse dirigée est un processus d'introduction de la mutation souhaitée au moyen d'une amorce. La mutation peut être une substitution, une insertion ou une délétion. Comme la spécificité de la PCR diminue avec l'augmentation des nucléotides mésappariés dans l'amorce, la PCR traditionnelle ne peut introduire qu'une ou deux modifications de paires de bases dans la séquence cible. D'autres méthodes telles que l'extension d'amorce et la PCR inverse peuvent être utilisées pour introduire des mutations à grande échelle. La conception de l'amorce dans la mutagenèse dirigée est illustrée à la figure 2.

Figure 2: Amorces pour la mutagenèse dirigée

Substitution

Pour les substitutions, l'une des deux amorces doit contenir la mutation souhaitée au milieu de l'amorce. Ici, le site qui contient la mutation ne s'hybride pas à la séquence cible car il forme une distorsion.

Effacement

Pour les suppressions, la séquence à supprimer de la cible peut être négligée lors de la conception de l'amorce. Cette séquence étant située en dehors de la région flanquée par des amorces, elle ne serait pas amplifiée lors de la PCR.

Insertion

Pour les insertions, la séquence à ajouter est intriquée à l'extrémité 5' de l'une des amorces lors de la conception de l'amorce. Par conséquent, la séquence insérée peut également rester attachée à l'amplicon.

Conclusion

La mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations dans une séquence d'ADN. Ces mutations peuvent être des substitutions, des insertions ou des délétions. Des mutations à petite échelle peuvent être introduites dans la PCR traditionnelle. Des mutations à grande échelle peuvent être introduites dans l'extension d'amorce ou la PCR inverse. L'introduction de la mutation se fait par incorporation de la mutation souhaitée à l'amorce.

Référence:

1. "Méthodes de mutagenèse dirigée". TECHNOLOGIES D'ADN INTÉGRÉES, Disponible ici.

Image de courtoisie:

1. "Mutagenèse dirigée sur site" par Knbusby - Travail personnel (domaine public) via Commons Wikimedia