La PCR quantitative ou en temps réel est utilisée comme test de routine pour le suivi des changements relatifs de l'expression génique dans différentes conditions expérimentales. La conception d'amorces ainsi que de sondes pendant la QPCR est l'un des facteurs les plus cruciaux qui affectent la qualité et le succès du test. Plusieurs directives s'appliquent à la conception des amorces pour la QPCR: la teneur en GC des amorces doit être de 35 à 65 %; la température de fusion des amorces doit être comprise entre 60 et 68 °C; il faut aussi éviter les structures secondaires, les répétitions de Gs ou Cs plus longues que 3 bases, et la formation d'amorces-dimères.

Domaines clés couverts

1. Qu'est-ce que la QPCR - Définition, processus, utilisations 2. Comment concevoir des amorces pour QPCR – Lignes directrices pour la conception de l'amorce pour la QPCR

Termes clés: colorants fluorescents, contenu GC, température de fusion, amorces, PCR quantitative (QPCR)

Qu'est-ce que la QPCR

La QPCR est un type de PCR qui permet la quantification du produit en temps réel. Les colorants fluorescents peuvent être utilisés dans la quantification des produits PCR en les marquant à chaque étape. Deux méthodes de marquage fluorescent peuvent être utilisées dans les dosages QPCR. Il s'agit de l'utilisation de colorants fluorescents et de sondes marquées par fluorescence. Les colorants fluorescents se lient au produit PCR tandis que les sondes s'hybrident avec le produit PCR pour former un ADN triplex stable. Le colorant fluorescent largement utilisé dans QPCCR est SYBR Green tandis que les sondes peuvent être Taqman. L'utilisation de sondes dans la détection des produits PCR pendant la QPCR donne des résultats plus précis et augmente la sensibilité du test.

Figure 1: Mécanisme de QPCR

Comment concevoir des amorces pour QPCR

La conception d'amorces pour la QPCR est cruciale pour augmenter la fiabilité, la précision ainsi que la sensibilité du test. Les directives pour la conception des amorces QPCR sont décrites ci-dessous.

1. Produit PCR/taille de l'amplicon – La taille du produit PCR doit être de 50 à 210 paires de bases.
2. Longueur des amorces – La longueur des amorces doit être de 19 à 23 nucléotides.
3. Teneur en GC – La teneur en GC des amorces doit être comprise entre 35 et 65 %.
4. Température de fusion (Tm) – La température de fusion des apprêts doit être de 60 à 68 °C. La température de recuit pour le dosage est inférieure de 5 °C à la Tm des amorces.
5. Jonction exon-exon - Lors de l'amplification de l'ADNc par QPCR, les amorces doivent couvrir la jonction exon-exon pour éviter l'amplification de l'ADN contaminant.
6. Répétitions et analyses – Les répétitions de dinucléotides (TCTCTCTCTC) et les nucléotides répétés (par ex. TAAAAAAAGC) doivent être évités.
7. Complémentarité 3' - Les régions complémentaires des extrémités 3' des amorces directes et inverses doivent être évitées pour empêcher la formation d'amorces-dimères.
8. Stabilité 3' - Les résidus G ou C doivent être inclus à l'extrémité 3' de l'amorce pour augmenter la stabilité de l'hybridation.
9. Pince GC - Une ou deux pinces GC à l'extrémité 5 'de l'amorce augmente la spécificité de l'hybridation.
10. Spécificité – La spécificité des amorces doit être vérifiée par BLAST
11. SNP - Les amorces ne doivent contenir aucune variation connue de SNP (polymorphisme nucléotidique unique)

Plusieurs outils en ligne peuvent être utilisés dans la conception d'amorces en QPCR, tels que Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank et OAT.

Figure 2: Formation d'amorces-dimères

Les amorces doivent être conçues de manière à éviter la formation d'amorces-dimères en QPCR. Il est essentiel lors de l'utilisation de colorants fluorescents pour la détection du produit PCR car ces colorants se lient également aux amorces-dimères pour donner des résultats faussement positifs.

Conclusion

La QPCR est utilisée dans la détection et la quantification des produits de PCR. La conception d'amorces est cruciale en QPCR pour augmenter la précision des résultats. Il est donc important de suivre attentivement les directives dans la conception des amorces pour la QPCR.

Référence:

1. "Conception et optimisation du test QPCR". LSR | Bio-Rad, disponible ici.

Image de courtoisie:

1. "Taqman" par utilisateur: Braindamaged - Travail personnel du téléchargeur d'origine (domaine public) via Commons Wikimedia2. "Formation de dimères d'amorces En" Par Tzachi Bar - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia