Le séquençage est le processus impliqué dans la détermination d'une séquence nucléotidique d'un fragment d'ADN particulier. Pendant le séquençage, le fragment d'ADN est marqué de manière terminale avec des nucléotides marqués par fluorescence par PCR. Ce processus utilise quatre types de nucléotides marqués par fluorescence, et ce sont des didésoxynucléotides (ddNTP). Les ddNTP n'ont pas de groupe OH 3' auquel le groupe phosphate du nucléotide entrant est attaché. Par conséquent, lorsqu'un ddNTP est ajouté à la chaîne en croissance, il n'y aura plus d'ajout de nucléotides à l'extrémité 3' de la chaîne. Cela signifie que l'ajout d'un ddNTP dans la chaîne en croissance met fin à la croissance de la chaîne. Étant donné que les ddNTP sont ajoutés au mélange PCR à de faibles concentrations, chaque chaîne en croissance est terminée à des niveaux différents. La fluorescence émettrice est détectée pour déterminer la séquence nucléotidique du fragment d'ADN à la fin de la PCR.

Domaines clés couverts

1. Qu'est-ce que le séquençage de l'ADN - Définition, types 2. Comment fonctionne le séquençage de l'ADN – Processus de séquençage de l’ADN

Termes clés: didésoxynucléotides (ddNTP), marqueur fluorescent, électrophorèse sur gel, séquençage de nouvelle génération, séquence nucléotidique, PCR, séquençage de Sanger

Qu'est-ce que le séquençage de l'ADN

Le séquençage de l'ADN est une technique de laboratoire utilisée dans la détermination de la séquence nucléotidique d'une molécule d'ADN particulière. Il utilise des nucléotides marqués par fluorescence, qui sont incorporés pendant la PCR. Il existe deux méthodes principales de séquençage basées sur les techniques utilisées dans la détection de la fluorescence: le séquençage de Sanger et le séquençage de nouvelle génération.

Séquençage de Sanger

Le séquençage de Sanger, développé par Fredric Sanger en 1975, est la première méthode de séquençage développée. Il est également connu sous le nom méthode de terminaison de chaîne depuis il est impliqué dans l'incorporation sélective de ddNTP à terminaison de chaîne au cours de la synthèse d'ADN in vitro. Dans le séquençage de Sanger, les amplicons sont séparés par électrophorèse sur gel. Le séquençage Sanger est largement utilisé pour la détermination de la séquence des fragments d'ADN utilisés dans le clonage et des fragments amplifiés par PCR. Une séquence d'ADN déterminée est montrée dans Figure 1.

Figure 1: Séquençage de l'ADN

Séquençage de nouvelle génération

Les technologies de séquençage de l'ADN les plus récentes sont collectivement connues sous le nom de séquençage de nouvelle génération. C'est aussi une méthode de terminaison de chaîne. Le séquençage de nouvelle génération utilise l'électrophorèse capillaire pour la séparation d'amplicons de différentes longueurs créés par la méthode de terminaison de chaîne. Le séquençage de nouvelle génération est utilisé dans la détermination d'un grand nombre de nucléotides par analyse, comme dans le séquençage du génome.

Comment fonctionne le séquençage de l'ADN

Au cours du séquençage de l'ADN, des nucléotides marqués par fluorescence sont ajoutés à un fragment d'ADN particulier par PCR. Pour l'allongement du brin d'ADN, des désoxynucléotides réguliers (dNTP) sont utilisés. Cependant, des ddNTP sont ajoutés au mélange réactionnel, qui est marqué par fluorescence. Étant donné que les ddNTP n'ont pas de groupe OH 3' dans la molécule de sucre désoxyribose, une croissance supplémentaire de la chaîne peut ne pas se produire, mettant fin à la croissance de la chaîne. Le squelette sucre-phosphate de l'ADN est formé par la formation de liaisons phosphodiester entre le groupe 3' OH du sucre désoxyribose et le groupe phosphate du nucléotide entrant. Cependant, les ddNTP sont ajoutés en faibles concentrations; par conséquent, ils ne terminent pas la croissance de la chaîne à la fois.

Quatre types de ddNTP sont ajoutés à quatre mélanges PCR distincts. Quatre réactions PCR distinctes sont effectuées en ajoutant ddATP, ddGTP, ddCTP et ddTTP. Par conséquent, dans chaque mélange réactionnel, la croissance de la chaîne se termine respectivement aux nucléotides A, G, C et T. A titre d'exemple, dans le mélange réactionnel avec ddATP ajouté, la croissance de différents amplicons est terminée à chaque nucléotide A dans le fragment d'ADN. La détermination de la séquence d' ADN par séquençage de Sanger est illustrée à la figure 2.

Figure 2: Séquençage de Sanger

Chacun des quatre types de nucléotides est marqué par une couleur de fluorescence distincte; les le ddATP est marqué avec un colorant vert; les ddGTP est étiqueté avec un colorant jaune; les ddCTP est marqué en bleu; les ddTTP est étiqueté avec un colorant rouge. Par conséquent, les amplicons des quatre réactions PCR sont étiquetés dans des couleurs distinctes.

Après l'amplification du fragment d'ADN intéressé, les amplicons sont séparés soit par électrophorèse sur gel, soit par électrophorèse capillaire. La séquence nucléotidique du fragment d'ADN peut être déterminée par la détection de la fluorescence émettrice. La séquence de nucléotides de 750 à 1 000 paires de bases de longs fragments peut être facilement déterminée par analyse par séquençage de Sanger. Cependant, la détermination de la séquence nucléotidique d'un génome entier reste problématique en raison d'un grand nombre de nucléotides dans les génomes. Cependant, les techniques de séquençage de nouvelle génération telles que le séquençage 454, environ 20 millions de paires de bases peuvent être lues par analyse unique.

Conclusion

Le séquençage de l'ADN est une technique de biologie moléculaire utilisée dans la détermination de la séquence nucléotidique de fragments d'ADN. Lors du séquençage, des nucléotides marqués par fluorescence sont ajoutés aux fragments d'ADN par PCR. En détectant la fluorescence émettrice, la séquence nucléotidique peut être déterminée.

Référence:

1. "Séquençage de l'ADN". Khan Academy, disponible ici.

Image de courtoisie:

1. "Séquence d'ADN" de Sjef - Travail personnel, domaine public) via Commons Wikimedia 2. "Didesoxy-Methode" de Christoph Goemans (modifiziert) - Dr Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia