Le séquençage de l'ADN est une technique qui permet de déterminer la séquence nucléotidique d'une molécule d'ADN particulière. Les deux méthodes de séquençage sont le séquençage de Sanger et le séquençage de nouvelle génération. Les deux types de méthodes de séquençage sont entièrement automatisés à jour. Tout brin d'ADN est composé des quatre nucléotides: adénine (A), guanine (G), cytosine (C) et thymine (T). Les nucléotides du fragment d'ADN sont marqués avec quatre marqueurs fluorescents séparés dans les deux types de méthodes de séquençage. Les marqueurs fluorescents ou fluorophores sont des molécules capables d'absorber la lumière et de l'émettre à une longueur d'onde bien définie. Les marqueurs fluorescents sont incorporés dans le brin d'ADN par PCR. Ensuite, la séquence des nucléotides est déterminée par des techniques automatisées.

Domaines clés couverts

1. Qu'est-ce que le séquençage - Définition, séquençage Sanger, séquençage de nouvelle génération 2. Comment les marqueurs fluorescents aident-ils à déterminer une séquence nucléotidique – Procédure de séquençage

Termes clés: didésoxynucléotides (ddNTP), marqueur fluorescent, électrophorèse sur gel, séquençage de nouvelle génération, séquence nucléotidique, PCR, séquençage de Sanger

Qu'est-ce que le séquençage

Le séquençage est une technique de laboratoire utilisée pour déterminer la séquence nucléotidique d'une molécule d'ADN. Deux principaux types de méthodes de séquençage de l'ADN peuvent être identifiés comme le séquençage de Sanger et le séquençage de nouvelle génération. Le séquençage Sanger et le séquençage de nouvelle génération utilisent tous deux des nucléotides marqués avec fluorescence pour la détermination de la séquence nucléotidique.

Séquençage de Sanger

Le séquençage de Sanger est la première méthode développée de séquençage de l'ADN. La méthode de séquençage a été développée pour la première fois par Fredric Sanger en 1975. Par conséquent, elle est connue sous le nom de séquençage de Sanger. La méthode de séquençage de Sanger est également connue sous le nom de méthode de terminaison de chaîne car il est impliqué dans l'incorporation sélective de didésoxynucléotides à terminaison de chaîne (ddNTPS) par l'ADN polymérase lors de la synthèse d'ADN in vitro. L'allongement du brin d'ADN est réalisé par les désoxynucléotides réguliers (dNTP). Cependant, des ddNTP sont ajoutés au mélange réactionnel pour terminer la croissance de la chaîne. Ces ddNTP sont marqués par fluorescence. Les quatre types de ddNTP sont ajoutés à quatre mélanges PCR distincts. Par conséquent, quatre réactions PCR distinctes sont effectuées en ajoutant ddATP, ddGTP, ddCTP et ddTTP. Dans chaque mélange réactionnel, la croissance de la chaîne se termine respectivement à chaque nucléotide A, G, C et T. A titre d'exemple, dans le mélange réactionnel avec ddATP ajouté, la croissance de différents amplicons est terminée à chaque nucléotide A dans le fragment d'ADN. Ensuite, ces quatre réactions sont séparées par électrophorèse sur gel, et un fluoromètre est utilisé pour rechercher la fluorescence séparée. Le séquençage Sanger est largement utilisé pour la détermination de la séquence des fragments utilisés dans le clonage d'ADN et des fragments amplifiés par PCR. Les séquences nucléotidiques déterminées sont présentées dans la figure 1.

Figure 1: séquences d'ADN

Séquençage de nouvelle génération

Les technologies de séquençage de l'ADN les plus récentes sont collectivement connues sous le nom de séquençage de nouvelle génération. Les réactions de séquençage sont réalisées à l'échelle microscopique sur une puce à la fois. Par conséquent, plusieurs réactions de séquençage sont effectuées en parallèle. Dans le séquençage de nouvelle génération, l'électrophorèse capillaire est utilisée en plus de l'électrophorèse sur gel pour la séparation d'amlicons de différentes longueurs créés par la méthode de terminaison de chaîne. L'électrophorèse capillaire est une méthode de séparation analytique par laquelle les molécules sont séparées en fonction de leur mobilité électrophorétique.

Comment les fabricants de produits fluorescents aident-ils à déterminer une séquence nucléotidique

Lors du séquençage, l'ADN à séquencer sert de brin matrice pour la synthèse d'ADN par PCR. Une amorce d'ADN est utilisée pour l'initiation de la synthèse d'ADN par l'ADN polymérase. Un mélange de quatre bases régulières (dNTP; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) et un faible niveau de l'un des quatre didésoxynucléotides (ddNTP; ddATP, ddGTP, ddCTP et ddTTP) sont ajoutés en tant que composants de la réaction PCR. Par conséquent, quatre réactions de PCR individuelles sont effectuées par l'ajout de chacun des quatre ddNTP. Les didésoxynucléotides possèdent deux caractéristiques particulières:

1. Ils manquent de groupe 3'-OH auquel le nucléotide entrant est ajouté par l'ADN polymérase. Par conséquent, l'incorporation du ddNTP met fin à la croissance de la chaîne.
2. Ils sont marqués avec différents colorants fluorescents: le ddATP est marqué avec un colorant vert, les ddGTP est étiqueté avec un colorant jaune, les ddCTP est marqué en bleu, et le ddTTP est étiqueté avec un colorant rouge.

Cependant, les ddNTP de terminaison de chaîne sont ajoutés en faibles concentrations; ils ne terminent pas tout le processus de PCR en une seule fois. Mais, lorsque l'un des quatre ddNTP est incorporé dans la chaîne en croissance, cette croissance de chaîne particulière est terminée. Par conséquent, à la fin de chacune des quatre réactions PCR, une série d'amplicons (les fragments d'ADN résultants par PCR) sont produits, qui se terminent à chaque nucléotide du fragment d'ADN cible. Ces amplicons peuvent être exécutés dans un gel. Les colorants fluorescents qui passent à un point défini du gel électrophorétique peuvent être scannés par un fluoromètre afin de déterminer la séquence nucléotidique dans les séquenceurs d'ADN automatisés. La séquence nucléotidique marquée par fluorescence obtenue dans le séquençage de l'ADN est illustrée à la figure 2.

Figure 2: Séquence nucléotidique marquée par fluorescence

En combinant chacun des nucléotides de la série, la séquence nucléotidique du fragment d'ADN initial peut être déterminée. La séquence nucléotidique d'un fragment de 750 à 1 000 paires de bases peut être facilement déterminée par analyse par séquençage de Sanger. Cependant, le séquençage d'un génome entier reste encore problématique en raison de la présence d'un grand nombre de nucléotides. Le séquençage 454 est un type de séquençage de nouvelle génération grâce auquel 20 millions de paires de bases peuvent être lues par analyse unique.

Conclusion

Le séquençage est une technique utilisée dans la détermination de la séquence nucléotidique d'un fragment d'ADN particulier. Le séquençage de Sanger et le séquençage de nouvelle génération sont les deux principales technologies de séquençage. Les deux technologies utilisent des marqueurs fluorescents pour la détermination de la séquence nucléotidique. Chacun des quatre didésoxynucléotides à terminaison de chaîne est marqué avec quatre colorants fluorescents différents, et ils sont utilisés dans quatre réactions PCR distinctes pour obtenir la séquence.

Référence:

1. Adams, Jill U. "Technologies de séquençage de l'ADN". Nature News, Nature Publishing Group, disponible ici. 2. Carr, Steven M. Séquençage fluorescent, disponible ici. 3. "Séquençage de l'ADN - Séquençage automatisé avec des colorants fluorescents." Articles JRank, disponibles ici.

Image de courtoisie:

1. «Alineando secuencias (2)» de Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) via Flickr 2. «Radioactive Fluorescent Seq» de Abizar sur Wikipedia anglais (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia