Le Western blot est une technique de biologie moléculaire utilisée dans la détection d'une protéine spécifique dans un échantillon. Il utilise SDS-PAGE pour séparer les protéines en fonction de leur taille et ces protéines séparées sont ensuite transférées dans une membrane. Cette technique utilise des anticorps primaires spécifiques dans le marquage d'une protéine particulière dans le transfert. Les anticorps secondaires marqués avec des protéines rapporteurs détectent les protéines marquées avec l'anticorps primaire.

Domaines clés couverts

1. Qu'est-ce que le Western Blot - Définition, faits, applications 2. Comment fonctionne le Western Blot – Processus de Western Blot

Termes clés: développement de la couleur, membrane de nitrocellulose, anticorps primaire, anticorps secondaire, transfert de Western

Qu'est-ce que le Western Blot

Le Western blot est une technique d'hybridation utilisée dans la détection d'une protéine particulière dans un échantillon. On l'appelle également immunoblot car la technique utilise des anticorps à la fois pour marquer la protéine d'intérêt et pour la détection des protéines marquées par des anticorps.

Figure 1: Western Blot

Le Western blot a été développé pour la première fois par Towbin en 1979, et il est actuellement utilisé comme technique de routine d'analyse des protéines.

Comment fonctionne le Western Blot

Le Western blot est principalement utilisé dans la détection d'une protéine spécifique dans un échantillon. Les étapes de la technique de Western blot sont décrites ci-dessous.

1. FDS-PAGE – L'échantillon de protéines est séparé en fonction de leur taille par SDS-PAGE.
2. Transférer des protéines sur une membrane – Les protéines fractionnées par taille sont transférées dans une membrane de nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène (PVDF). La technique impliquée dans ce transfert est le transfert par diffusion.
3. Blocage de sites non spécifiques – Les sites inoccupés de la membrane sont bloqués pour empêcher la liaison non spécifique des protéines. Le lait écrémé en poudre ou l'albumine sérique bovine (BSA) peuvent être utilisés à cette fin.
4. Incubation primaire d'anticorps – La membrane bloquée est incubée avec une solution d'anticorps primaire. Ces anticorps primaires se lient à une protéine particulière sur la membrane.
5. Incubation secondaire des anticorps – La membrane est incubée avec des anticorps secondaires, qui se fixent sur les anticorps primaires. Les anticorps secondaires sont conjugués à des protéines rapporteurs. Ces protéines rapporteurs peuvent être la biotine, la phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort.
6. Détection de protéines par développement de couleur – Les rapporteurs enzymatiques conjugués réagissent avec leur substrat pour générer une phosphatase alcaline colorée qui convertit le BCIP en un produit de couleur bleue tandis que la peroxydase de raifort convertit le luminol en émettant une luminescence.

Figure 2: Western Blot - Procédure

Conclusion

Western blot est une technique d'hybridation utilisée dans la détection de la présence d'une protéine particulière dans un échantillon. Il utilise SDS-PAGE pour séparer les protéines en fonction de leur taille et de leur liaison avec des anticorps primaires, qui peuvent être reconnus par des anticorps secondaires pendant le développement de la couleur.

Référence:

1. « Principe fondamental du Western Blot, comment fonctionnent les Western Blots ». Boster, Disponible ici.

Image de courtoisie:

1. «Immunoblot à l'acide anti-lipoïque» de TimVickers - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. «Western Blotting» de Cawang - Travail personnel, CC0) via Commons Wikimedia